sgRNA设计、高效率靶点载体构建、活性筛选

1、根据客户提供的基因信息，设计并构建至少3条或3对cas9/sgRNA表达载体，在293细胞或目的细胞中进行活性筛选，最后提交错配酶切结果及构建好的sgRNA表达载体。

图：sgRNA活性筛选T7E1测试结果

2、高效率靶点载体构建（适用于哺乳动物细胞）

（新颖的cas9表达系统，高效的编辑效率，省时，省费用！）

CRISPR/Cas9基因编辑，即Cas9酶在gRNA引导下，靶向基因组并剪断DNA，形成DNA双链断裂（DSB），细胞通过NHEJ和HDR两种方式对DSB进行修复，进而产生片段或碱基缺失，插入，替换等，利用该特点进行基因敲除（KO）和敲入(KI)。改造后的CRISPR/Cas9还可以实现基因激活、抑制和表观遗传调控等。

细胞基因编辑中几个重要的影响因素：

1、        合适的Cas9酶和gRNA表达系统（哺乳动物可选择表达系统较多）

2、        设计筛选到高活性gRNA靶点（一般设计3-6个靶点进行筛选，费时步骤）

3、        CRISPR质粒的导入（转染效率低的细胞编辑效率很低，实验很难进行）

4、        单克隆筛选（如果编辑效率低，将更加费时费力）

吉荧生物提供新型CRISPR 表达系统，上述问题迎刃而解!

原理：该载体是一种可以在细胞中复制的载体，就像普通质粒在细菌中复制一样。高效CRISPR质粒上包含了所有基因编辑元件和筛选基因，属于All-In-One vector，使用非常简单，只要将质粒转入细胞中，用嘌呤霉素筛选几天就可以敲除基因，效率可高达100%（见下图）。

高效CRISPR的优点总结如下：
1. 可以长时间编辑细胞，实现高效的基因敲除
2. 载体含有Puromycin抗性基因，可以富集转染成功的细胞，不受转染效率影响
3. 载体含有GFP，可以监测转染效率，还可以用流式分选细胞
4. 载体可以同时表达两个gRNA，编辑两个基因或者敲除一段DNA片段
5. 撤除筛选药物后，高效表达质粒在一周内迅速丢失，编辑好的细胞不再含有外源基因

载体图及案例展示

第15天获得接近100%的编辑效率！（酶切位点的突变）

订购注意事项：

1、        您提供基因名称（基因ID）

2、        我们提供构建好gRNA靶点的高效CRISPR载体(含puro，GFP双筛选标记)

周期约10工作日

参考文献：[1] Xie et al. An episomal vector-based CRISPR/Cas9 system for highly efficient gene knockout in human pluripotent stem cells. Sci Rep. 2017 May 24;7(1):2320.